Введение в медицинскую генетику.

  С 1956 г. анатомия человеческого генома была описана на основе хромосомного учения,генетического картирования и структуры последовательностей ДНК. Анатомия Андриаса Везалия, опубликованная в 1543 г., сыграла ведущую роль в развитии современной медицины. Цель этой статьи показать, что знание человеческого генома имеет существенное значение для всех областей медицины. Способность расшифровывать человеческий геном произвела смещение центра исследований в клинику, с генетического на белковый уровень, открыла возможность проследить путь от единичного редкого, индивидуального, измененного гена до распространенных заболеваний. Генетическая анатомия позволяет медицине стать более предиктивной и превентивной. Это делает диагностику и лечение более чувствительной, эффективной, специфичной и целостной. Но возможны и случаи злоупотребления. Просвещение как общественности так и профессиональных медиков позволит выгодно реализовать нео-Везалианскую медицину.

Линейное устройство генов в наших хромосомах - часть нашей микроанатомии. Когда мы говорим о составлении генетических карт хромосом, мы употребляем картографическую метафору. Ровно также мы употребляем анатомическую метафору когда говорим об анатомии человеческого генома.(1-3). Клиническая цитогенетика (начавшая свое существование в конце 1950-х), генетическое картирование хромосом (начавшееся для аутосом в конце 1960-х), и подробная расшифровка структуры ДНК хромосом (начатая в конце 1980-х) стали, говоря словами Чарльза Скрайвера (Charles Scriver), (устное сообщение 1882 года) - нео-Везалианскими основами медицины. Влияние на медицину было вполне сравнимо с трудом Andreas Vesalius (de corporis humani Fabrica), который был опубликован в 1543 г. и послужил основой для физиологии кровообращения Harvey (1628) и патологической анатомии Morgagni (1761).

История медицинской генетики (4) может быть поделена на 2 периода: до 1956 г. – здесь ее достижения восходят к Менделю и большей частью к успехам первой половины 20 века, и последующий период после 1956 г., в течении которого медицинская генетика развилась в законченные медицинские и академические области деятельности. В центре внимания данной статьи - результаты влияния хромосомного учения, генного картирования и секвенирования ДНК ( the Human Genome Project – HGP ) на развитие медицинской генетики с 1956 г.

Клиническая цитогенетика ( Хромосология ).

1956 г. был переломным моментом в истории медицинской генетики. В этом году было обнаружено, что диплоидный набор хромосом составляет 46 (а не 48, как предполагали ранее)..(5,6). Замечательно, что это произошло спустя 3 года после открытия двойной структуры ДНК Уотсоном и Криком (7), что и помогло определить верное количество хромосом человека. Это открытие было значительным для медицины, потому что развитие техники к тому моменту позволило выполнять хромосомный анализ для изучения заболевания и постановки диагноза. Медицинская генетика, которая не считалась клинической дисциплиной до 1956 г., получила свой «предмет» для изучения – ядро клетки, такой же, как сердце в кардиологии и нервная система в неврологии.

Но только правильное определение количества хромосом и развитие техники позволило уже в 1959 г. Jerome Lejeune найти маленькую добавочную хромосому, отвечающую за монголизм (синдром Дауна). Позже были обнаружены другие аномалии количественного состава половых хромосом при синдромах Тернера и Клайнфельтера. В начале 1960-х аномалии количества и структуры хромосом были описаны при других врожденных патологических синдромах, таких как трисомии 13 и18, разнообразные транслокации, делеции, мозаичность, и триплоидии (в тканях спонтанных абортусов). В 1960 г. были открыты изменения хромосомного состава при хронической лейкемии (9), подтвердившие ранее выдвинутую Теодором Бовери (Theodor Boveri) хромосомную теорию рака (10). Одна разновидность лейкоза была связанна с лишней частично делетированной 21 хромосомой, которая была названа - по месту жительства пациента и исследователя открывшего ее - Филадельфийской хромосомой (Ph1) . Развитие техники дифференциальной окраски хромосом в 1973 г. показало, что лишняя хромосома 22, а не 21, и что измененная в этом случае аномально короткая Ph1 хромосома результат скорее транслокации между 9 и 22 хромосомами (11).

Способность обнаруживать клетки с хромосомными аберрациями в амниотической жидкости дало возможность проводить пренатальную диагностику синдрома Дауна и других хромосомных заболеваний при помощи амниоцентеза, начиная с 1966 г. Характеристика культур клеток при дефектах ферментов дало возможность так же осуществлять пренатальную диагностику метаболических заболеваний при изучении клеток амниотической жидкости.

Около 1970 г. различные методики дифференциальной окраски хромосом развились настолько успешно, что позволили увидеть продольную исчерченность структуры хромосом. Хорошо выраженный образец этих «полосок» (banding) позволил идентифицировать каждую хромосому. Этот метод был применен для исследования клетки в определенной фазе деления, когда хромосомы раскручены, и тогда стало возможным узнавать малейшие делеции и перестройки в структуре этих хромосом. Анализ корреляций кариотипа и фенотипа легло в основу описания новых синдромов, связанных с микроделециями хромосом, таких как синдром Вильямса (online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) 104050), и родственных синдромов «протяженного гена» (contiguous gene syndromes), таких как синдром DiGeorge (OMIM 188400) (12). Сверх того - это позволило произвести прорыв в исследовании злокачественных заболеваний в гематологии и показало их связь с взаимной транслокацией и созданием объединенных генов. Филадельфийская хромосома была одной из первых, природа которой была установлена, сейчас таких хромосом более 100 (13).

За последние 20 лет, молекулярная цитогенетика, «chromosome painting» и гибридизация in situ позволили определять локальные делеции и перестройки хромосом и являются методами для характеристики кариотипа в клинической практике.

Картирование генов.

Первым геном картированным на специфической хромосоме у многих видов был один из генов дальтонизма. В 1911 цитолог E.B.Wilson (14) заключил на основании родословной, что данное заболевание описанное Pliny Earle в Филадельфии, Pa в 1845 (15) и Friedrich Horner в Цюрихе ( Швейцария,1876 ), может быть описано как рецессивный признак сцепленный с Х хромосомой. А, следовательно, генетическая конституция мужчины и женщины может быть описана как ХУ и ХХ, соответственно. В последующее десятилетие несколько заболеваний аналогичным (дедуктивным) анализом было связано с Х хромосомой. Это было отражено во втором издании Mendelian Inheritance in Man в 1968 (12), где каталог Х сцепленных фенотипов содержал 68 состояний. Точная локализация на Х хромосоме гена дальтонизма была не известна: первое региональное картирование связало ген дальтонизма и G6PD недостаточность (16), которые находились на дистальном конце длинного плеча Х хромосомы в 1973 (17)

Но в 1968 г. уже был картирован первый ген на аутосоме, отвечающий за группу крови Даффи (18). Это было впервые доказано Roger Donahue ( Johns Hopkins University PhD candidate in human genetics ) при исследовании гетероморфизма 1 хромосомы в своей собственной семье.

Большая часть прогресса генного картирования в 1970-х годах (19) получена благодаря изучению соматических клеток гибридов человека и мыши (20). Ранним примером такого картирования (1971) был ген кодирующий фермент тимидинкиназы на 17 хромосоме (21).

Молекулярная генетика подошла к картированию генов около 1980 года с помощью 3-х методических приемов : (1) Снабжение ДНК зондами для анализа соматических гибридных клеток ; (2) Введение ДНК зондов ( вначале радиоактивных, затем флюоресцентных) для in situ гибридизации в хромосомах. Этот прямой метод для прямого картирования был впервые применен на практике в 1981 г. (22) ; (3) Особенно важно, что молекулярная генетика дала избыточное количество ДНК маркеров, что может быть использовано для генетического сцепления в семейных случаях (23). Первоначально такие исследования были серьезно стеснены небольшим количеством маркеров. Сейчас ДНК маркеры представлены полиморфными рестрикционными фрагментами, вариабельными тандемными повторами, микросателлитами или короткими тандемными повторами, и полиморфными моно-нуклеотидами.

С 1985 года, когда начался проект генома человека (HGP), было известна локализация примерно 700 генов. Это были гены отвечающие за группы крови, некоторые ферменты, структурные белки, и т. д. Часто во время картирования генов основа дефекта, т.е. дефектный белок, была не известна. Полезность карт генного картирования для клинической медицины стала очевидной при соединении несистематизированных данных. Изобилие ДНК маркеров позволило найти клиническое применение этим данным. Первым заболеванием, картированным с помощью ДНК маркеров, была хорея Гентингтона (1983), ген которой был локализован на конце короткого плеча 4 хромосомы (24). Клиническое применение этой информации очевидно. При помощи этого метода стало возможно проводить пренатальную и преморбитную диагностику. Значительный прорыв в сфере проведения предсказательного тестирования ДНК привел к ряду психологических проблем.

Другое полезное применение генных карт для изучения дефектных генов открылось со стороны позиционного клонирования (25), однако для этого требовалось время. Так ген болезни Гентингтона был изолирован с помощью позиционного клонирования только в 1993 году (26). Выяснилось, что исследуемый регион достататочно примечателен, так как является локусом для нового типа мутаций в виде вариабельных тринуклеотидных повторов.

Первые 4 успеха связанные с применением позиционного клонирования для исследования заболеваний были связаны со следующими заболеваниями: хронический грануломатоз (27) и мышечная дистрофия Дюшенна (28) в 1986; ретинобластома и муковисцидоз в 1989 (29). Муковисцидоз был первым заболеванием верифицированным путем позиционного клонирования без применения цитогенетического анализа.

В следующее десятилетие, методика картирования генов заняла лидирующее место в области биомедицинских исследований. Специалисты разных областей медицины использовали эти знания для решения задач в своей области. К тому же специалисты с лучших позиций расшифровали патогенетические механизмы связи между геном и феном, генотипом и фенотипом.

Окончательная анатомия: секвенирование генома человека

Как было замечено ранее, большинство генов, которые были картированы до проекта HGP, были картированы формально. К тому же технические возможности клонирования для изоляции пораженного гена были постигнуты и получили принципиальную основу только в 1986.

ДНК была открыта в ХIX веке. То, что ДНК является хранилищем генетической информации, было впервые установленно Avery, McLeod, и McCarty в 1944 г . на примере пневмококка (30). Они нашли, что так называемый трансформирующий фактор, который превращает один вид пневмококка в другой и есть ДНК. В 1953 г. Уотсон и Крик (7) выявили двухцепочную структуру ДНК при помощи рентгеновской диффракции. Генетический код триплета нуклеотида, специфичный для каждой нуклеиновой кислоты был детально выяснен в 1966 г. В конце 60-х были открыты ограничительные ферменты, которые рассекали ДНК в определенных местах, и таким образом, могли послужить скальпелем для рассечения генома. В начале 70-х было обнаружено, что гены (включая также человека) могут быть клонированы в избытке и соединены с ДНК в бактерии плазмодия (31) и может быть выращена бактерия при помощи так называемой рекомбинативной ДНК технологии.

В 1977 г. об улучшении методики секвенирования ДНК было доложено Maxam and Gilbert (32) и Sanger et al. (33). Замечательно, что метод Sanger стал краеугольным камнем проекта Генома Человека (HGP); метод был модифицирован, автоматизирован и стал более эффективным, но остался принципиально основным в этих исследованиях.

Кольцевые хромосомы плазматических органел молочнокислых бактерий, в частности митохондрии, были полностью расшифрованы ( все 16 569 нуклеотидов ) группой Sanger в 1981 году. Таким образом некоторые исследователи были воодушевлены возможностью раскрыть полный клеточный геном. Как ранее и предполагалось, полная расшифровка последовательности нуклеотидов (секвенирование генома человека) пришла из лабораторий департамента Энергетики США, который был ответственен за работы по мутагенному эффекту радиации. Важно рассмотреть проблему рака, которая была затронута Renato Dulbecco (35) как главная мотивация для работ по HGP. Возможно, геномика нанесет решающий удар по раку. Событие полезное для понимания картирования всех генов в плане изучения врожденных дефектов произошло ранее (36). В 20-х годах Haldane указал на важность генетического сцепления в диагностике и в своей “Croonian Lecture” в 1948 г написал, что “…конечной целью должно быть перечисление и размещение всех генов найденных в нормальном человеческом бытие.”

Проект «Геном Человека» (HGP) обсуждали и планировали, спорили о нем между 1985 и 1990 годами. Официальным стартом программы в США является 1 октября 1990 (38). Национальный исследовательский совет \Национальная Академия Наук (NRC/NAS) как комитет (39) по картированию и структуре ДНК в человеческом геноме предположил, что полная карта генов и последовательность нуклеотидов может быть расшифрована в течении 10-15 лет и будет стоить около 200 миллионов долларов в год. В ретроспективе, это можно рассматривать как замечательное и проницательное заключение. Полимеразная цепная реакция была анонсирована на встрече в Cold Spring Harbor, NY в 1986 (40), где статус генетической карты Homo Sapiens был рассмотрен (41) и проект HGP активно обсуждался в финале конференции. Искусственные хромосомы дрожжей были открыты в 1987 г. искусственные бактериальные хромосомы и искусственные хромосомы плазмодия были позже использованы как другие механизмы для клонирования больших участков ДНК. Много полиморфных и других полезных связывающих маркеров, микросателлитов было открыто в 1989 и начале 90-х. В конце концов, однако, запас средств оказался не так велик.

NRC/NAS комитет рекомендовал - “ карта вначале, секвенирование позже” (39) –потому, что технология определения последовательности азотистых оснований была еще на не достаточно эффективном экономическом уровне и потому, что 2 карты: генетическая (микросателлитные маркеры и т.д (42)); и физическая (искусственные хромосомы клонов дрожжей (43) могли быть полезными для окончательной расшифровки последовательности нуклеотидов. Таким образом проект HGP Национального Института Здоровья был более или менее успешным к 1 октября 1990 когда эта программа было начата под руководством первого директора James D.Watson. Его последователем в 1993 году стал Francis S. Collins.

Другие рекомендации NRC/NAS комитета заключались в том, чтобы другие модельные организмы исследовалась параллельно с человеком (39). Сравнительная геномика является важной областью для понимания структуры и функций человеческого генома и его генов.

Метод Expressed Sequence Tags (EST) – комплементарные ДНК последовательности полученные путем обратной транскрипции от информационной РНК, был разработан в 1991 году (44). Его можно считать своеобразным «коротким или кодирующим геномом человека». Большое количество EST данных, как для человека так и для многих других видов, является ценным материалом для сравнительной геномики.

Первым свободно живущим организмом, геном которого был полностью расшифрован, была бактерия Haemophilus influenzae, с 1 830 137 нуклеотидами и около 1 800 кодирующих белки генов. Эта структура была расшифрована группой J. Craig Venter (45) c применением обратного подхода. Кольцевая ДНК бактериальных хромосом была разбита на сегменты, затем эти сегменты были клонированы и соединены наугад, а в индивидуальные последовательности были собраны через узнавание перекрывающихся концов. С того времени геномы значительного количества микроорганизмов были расшифрованы тем же самым способом, среди них Helicobakter pylori, Mycobacterium tuberculosis, и Treponema pallidum. В 1996, была полностью расшифрована структура первого ядерного ( эукариотического) организма - пекарских дрожжей (Saccharomyces cereviseae) (46). Нематода Caenorhabditis elegans , была первым многоклеточным организмом полностью расшифрованным в 1998 (47,48). А о секвенировании генетического животного Drosophila melanogaster было доложено в марте 2000 года (49). Первые 2 эукариота были секвенированы по методу “clone by clone”, а третий (дрозофила) в комбинации этого метода с методом случайности (“shotgun”).

Используя успех со случайной последовательностью нуклеотидов клона с последующим собранием в микроорганизме, Venter с коллегами применили тот же метод на человеке. Они основали частную компанию (Cerela Genomic Inc.) работающую по принципу фабрики: ДНК и получение клонов, секвенирование и объединение с автоматизацией и компютеризацией всех этапов. Подход контролировался подобным анализом секвенирования генома Дрозофилы. Геномы пяти добровольцев, представляющих 4 расовые группы и оба пола, были расшифрованы Cerela (50). Общий объем HGP поднялся на новый уровень ускорения и соперничества в координации работ с различными лабораториями США, Объединенного Королевства, Японии, Франции и Германии и других стран под руководством Francis Collins (51).

К данным полученным из общественного запаса HGP был обеспечен свободный доступ. Данные о секвенировании полученные Cerela были детально сравнены с общественной базой данных и содержанием компьютерных методов анализа, академическими методами исследования подписанными и фармацевтическими и другими неакадемическими лабораториями.

В Белом Доме 26 июня 2000 года Collins и Venter представили комплект первоначальных общественных и частных результатов секвенирования человека, которые были опубликованы в середине февраля 2001 года. Результаты общественного фонда опубликованы в журнале Nature (51), а результаты Cerela в журнале Science (50). Каждый журнал сопровождался статьей, содержащей новую информацию.

Когда полный результат секвенирования человеческого генома был полностью известен, то количество найденных генов составило только половину от ранее предсказанного (52) и немного больше чем двойное количество в очень простом организме, таком как нематода C. elegans. Например, возрастание сложности человека по сравнению с нематодой, достигается возрастанием количества различных белков кодируемых в единичных генах, через альтернативный сплайсинг мессенджеров РНК, посттранскрипционных и посттрансляционных модификаций, формированием гетеромерных белков (т.е. белков как продуктов комбинации транскриптов 2-х и более генов) и т.д. Оценка свидетельствует, что 30 000-40 000 генов кодирует в 10 раз большее количество белков. Результатом этого стало частичное смещение фокуса научных исследований с гена к белку и с геномного уровня на белковый уровень, т.е. от геномики к протеомике (53-55).

Другой интересной, но не новой информацией в секвенированном геноме человека (50,51) была неоднородная плотность генов в пределах хромосомы (гены обнаруживают тенденцию концентрироваться на концах хромосом) и между отдельными хромосомами. Хромосомы 19 и 22 особо богаты генами, а хромосомы 13, 18, и 21 относительно бедны. До завершения проекта HGP, информация об изменении генетической плотности была уже известна на основе количественного картирования генов и косвенно на основании определения количества определенных пар нуклеотидов GC vs AT по длине хромосом. Тем не менее более точная верификация в проекте HGP чрезвычайно важна.

Патологическая анатомия человеческого генома . Как далеко мы зашли?

Анатомическая метафора употребляется потому, что это простирается на сравнительную анатомию и эволюцию человеческого генома , а так же на функциональную анатомию , анатомию развития и, возможно в медицинском контексте, на патологическую анатомию (2)

Достижения в области патологической анотомии человеческого генома за последнии 40 лет занесены в MIM каталог человеческих генов и генетических болезней (12). Компьютеризированный с 1964, MIM был пионером в области компьютерных публикаций ( первое издание в 1966 ) и стал доступным в сети с 1987. Периодические печатные издания , последнее из них 12-е издание, опубликованное в 3-х томах в 1998 представило срез генетического поля медицины за последние 35лет. OMIM обладает преимуществом ежедневного обновления, доступностью для исследователя и легкостью соединения связи между различной информацией о структуре ДНК, структуре белка и соответствующей биомедицинской литературой. История MIM ( и OMIM) имеет опыт исчерпывающего каталога генетических данных, особенно генов связанных с заболеванием и исчерпывающий каталог специфических генетических мутаций. Количество генов с 1 и более приводящими к болезни мутациями приблизился к 1000 к 1 января 2001 (56). Суммарное количество охарактеризованных заболеваний - более чем 1 600, что превышает количество генов ответственных за заболевание (более чем 1 200), так как многие из таких генов могут служить причиной более чем одного заболевания. Например, В-глобин – ген, мутация которого вызывает серповидноклеточную болезнь, талассемию, гемолитическую анемию Heinz, метгемоглобинемию, эритремию и другие признаки. То есть феномен неожиданно низкого количества обнаруженных генов объясняется тем, что один ген отвечает более чем за один белок.

Куда мы пойдем от сюда?

Эти цитаты отражают как много мы не знаем:

“Область знаний простирается широко, а область неизвестного еще шире”
-- Anonymous

«Как такое малое количество знаний может давать так много информации?»
-- Noam Chomsky

Вскоре мы сможем завершить каталог генов, но мы не знаем всех белковых продуктов генов, функций всех белков, важность каждого из них в отдельности или всех вместе. Мы не знаем широту вариаций генов. Мы не знаем связей между структурными вариациями генов и вариациями их функций и отражением этих изменений в фенотипе. И это будет занимать биологию еще долгое время. Прогресс в проекте HGP произвел некоторый сдвиг нео-Везалианских основ медицины в сторону окончательной анатомии генома. Сдвиг с геномного (57) на белковый уровень (55) или небольшое продвижение в исследовании белков подводит к реализации нескольких или даже многих разных белков, которые могут быть закодированы единичным геном. Но мы не знаем механизмов возрастания сложности человека по сравнению с нематодой C. elegans и Drosophila, которые имеют всего лишь в три и в два раза меньшее число генов. Произошел сдвиг акцента от относительно редкого единичного дефектного гена к общим растройствам мультифакторной этиологии, благодаря чему стало возможно идентифецировать восприимчивый этиологичный аллель. Как следствие , ДНК тесты будут не долго ограничивать специфическую диагностику только менделирующих заболеваний , но могут расширить диагностику предрасположенности или резистентности для широко распространенных болезней.

Нео-Везалианское влияние на медицину 21 века.

Как показывают многие детали , ценность структуры человеческого генома и информация о связях белков с последовательностью нуклеиновых кислот вероятно изменила медицину во многих отношениях. Например влияние на репродуктивную медицину , что дало возможность проводить специфичную диагностику на ранних стадиях. Это приведет к уверенному прорыву в генной терапии. Различными путями генетика сделает медицину вероятно более предиктивной, а следовательно все более профилактической. Исчерпывающий скрининг генома для распознания индивидуальных предрасположенностей организма позволит предвидеть общее заболевание. Генетическая основа клинической медицины позволит врачам на снове генетического скрининга давать советы и проводить мероприятия для предотвращения развития заболевания.

В то же время в традиционной клинической медицине диагностика стала более специфичной и точной, а лечение более специфичным и безвредным. Генетическая база индивидуализировала медицинскую заботу, цель которой - индивидуальное лечение для индивидуального пациента (59). Более точная характеристика генома распространенных заболеваний , таких как артериальная гипертензия или психические заболевания, будет верифицировано генетическим методом и для каждого подобранно индивидуальное более эфективное лечение. Онкология использует генетику для более специфичной диагностики и лечения. Морфологически неразличимые новообразования “на уровне” их измененных геномов являются различными , исходя из чего лечение должно быть различным.

Лучшее понимание индивидуальной конституции генома позволит раз и навсегда изменить подход к лекарственной терапии. Это позволит выбирать лекарства вероятно более эффективные в лечении именно этого заболевания у именно этого пациента. Даже при специфической лекарственной терапии возможно эфективной при данном заболевании у данного пациента, генетическая конституция может увеличивать риск неблагоприятных реакций. Идентифицировав такой риск во время подбора лечения для данного пациента, можно значительно снизить количество ятрогенных заболеваний и летальность.

Особенно большой отдачи в экономическом плане стоит ожидать от фармакогенетики. Генноинженерные лекарственные средства и препараты индивидуально направленного действия позволят обеспечить прогресс в лечении и расширить спектр безопасных медикаментозных препаратов.

Однако прогресс в медицине несет опасности другого рода. Сохранение в тайне генетической информации и конфидициальность очень важны. Серьезен риск общественного непонимания, что может снизить получение максимальной выгоды от генетической информации. Слепой страх всего генетического - это одна проблема. Другая - это неправильное представление идеи о том, что фенотип прочно связан с генотипом. Это полезно для персонального понимания принципов возможного взаимоотношения со своим собственным здоровьем. Совершенно очевидно, что просвещение общественности и профессиональных сотрудников жизненно необходимо для того, чтобы нео-Везалианская медицина была реализована.